合膜用于CHO细胞上清液中抗体纯化研究

作者:化学

  本文描述了一种单抗纯化策略,应用最新的复合膜技术(MMMs)从CHO细胞上清液中纯化单抗。MMMs主要用在人IgG1纯化的捕获阶段,样品需要预先用脱盐柱处理以消除盐离子对IgG结合的干扰。当等效停留时间均为1 min时,MMM柱层析比蛋白A层析柱拥有更好的动态结合容量。尽管脱盐过程会导致目标蛋白稀释,两步法MMM层析在CHO细胞上清液纯化中表现处对hIgG1更高的选择性。通过分析洗脱液中目标蛋白的纯度以及杂质宿主蛋白,并将结果于商品化的蛋白A吸附柱进行对比。两种方法均可以达到目标蛋白纯度大于98%,杂质宿主蛋白含量小于20 ppm水平。尽管洗脱过程中低流速会稀释目标蛋白,MMM层析技术可以在中性条件下洗脱hIgG1,中性条件可以避免hIgG1在洗脱过程中发生聚集。综上,这篇文章介绍了MMMs技术应用于蛋白纯化的捕获阶段拥有很高的选择性,一些无法用蛋白A吸附柱进行纯化的抗体,比如对pH敏感的单克隆抗体或缺失Fc结合域的抗体纯化方面,MMMs技术拥有很好的应用前景。

  当今单克隆抗体(mAbs)被广泛应用于治疗肿瘤、心血管疾病及自身免疫性疾病等慢性疾病。美国FDA目前已批准了30种单克隆抗体,同时超过300种的单克隆抗体正处于临床试验当中。预计到2020年左右,上市的单克隆抗体药物的总销售额将达到1250亿美元。单抗药物非常昂贵并且生产工艺相对也比较复杂。其平均每个月的治疗花费约为10000美元。通过单抗药物的生产需要经过超过30个步骤,因此单抗药物高昂的花费某种程度上与其复杂的生产过程有关,其中包含多步骤的层析操作。

  Shukla and Thömmes建立了单抗纯化的下游工艺平台,首先经过一步用于捕获蛋白的层析步骤,接着是两步用于去除杂质的层析步骤。在商品化的单克隆抗体生产中,大部分试用蛋白A吸附柱作为目标蛋白捕获层析方法。Bolton andMehta最近研究了蛋白A应用的发展史,并且报道了其关于蛋白A被持续使用的见解。蛋白A对抗体的Fc域拥有很高的特异性,因此可以在纯化过程中只结合目的抗体而让宿主蛋白、DNA以及病毒碎片等杂质流穿。然而蛋白层析柱也有缺点和不足。

  首先,蛋白A层析柱在纯化不同种类的单抗时纯化效果有显著差异。Ghose等人报道同样的蛋白A层析柱对不同的单克隆抗体拥有完全不同的动态结合容量。蛋白A层析柱酸性的洗脱条件可能导致单抗解构并形成蛋白聚集体或异构体,提高了后续纯化的难度。同时在某些情况下,由于单抗在低pH条件下不稳定可能导致蛋白A层析失效。

  其次,蛋白A层析介质的动态结合容量低,且依赖流速;停留时间长;以及昂贵的配基成本等问题提高了单抗的生产成本,特别是现在发酵过程中单抗的表达量已经提高到了10g/L以上。尽管现在GE公司开发了停留时间为6 min时,动态结合容量大于60 mg/ml的蛋白A层析介质,目前大部分的蛋白A层析介质动态结合容量在40 mg/ml以下。蛋白A层析介质的价格远高于离子交换树脂,不同重复使用次数的介质从9000美元/升到12000美元/升不等。因此,一个直径1 m,柱床高50 cm的蛋白A层析柱要花费上百万美元,高昂的成本使企业更倾向于选择使用较小的柱子进行多次循环已取得相同的纯化效果,这也导致了纯化时间变得更长,批处理量变得更低。

  第三,在生产原料中蛋白酶的水解以及介质再生的作用下,蛋白A配基会从树脂表面脱落。尽管蛋白A层析柱被证明可以重复使用至少50次,但脱落的蛋白A是一种具有毒性的杂质,其可能引起病人的免疫反应,导致单抗聚集,增加单抗纯化的步骤和成本。

  单抗纯化过程中,蛋白A柱层析后续步骤是一步或多步离子交换层析或疏水层析。这些精纯步骤可以进一步提纯样品,降低产品有关的杂质含量,将宿主蛋白、DNA、内毒素、脱落的蛋白A以及单抗聚集体等杂质的含量降低到可接受水平。以上步骤对病毒的去除也有同样的效果。用于精纯的传统的离子交换层析要求对样品的pH和盐浓度进行预处理,同时其吸附选择性较低。而复合的材料对盐浓度以及pH并不敏感,同时对单抗具有高选择性。

  商品化的复合层析介质比如Pall公司的MEP HyperCelTM和GE公司的CaptoTMMMC已被广泛的研究。Gantier和他的合作者们进行了大量的实验对比离子交换复合树脂和蛋白A层析树脂的纯化效果。研究表明复合树脂表现的更有效,一步纯化即可以将单抗的聚集比例降低到0.5%以下,同时单抗纯度收率大于90%,宿主蛋白水平小于2500 ppm。

  虽然蛋白A亲和层析仍在被广泛应用,但是已有很多研究采用非亲和层析的方式进行蛋白捕获。帕利珠单抗和阿达木单抗使用了阳离子交换层析作为抗体捕获纯化介质,并且至少有其他29种在药审中心的单抗药物采用了非蛋白A的捕获纯化步骤。同样也有一些文献报道了非亲和膜用于蛋白纯化。阳离子交换层析的优势在于其与蛋白A层析介质具有相似的纯度及回收率的同时,阳离子交换介质成本更低,动态结合容量更高。阳离子交换捕获介质可以避免蛋白A脱落的风险,同时规避低pH的洗脱条件。非亲和方法将被更多的用在工业生产当中,用于纯化没有Fc结合域以及不耐受低pH的蛋白。膜技术的应用在工业生产上将越来越重要,特别是对于点对点的连续生物工艺过程。

  为了克服阳离子交换层析中需要对盐浓度进行预处理的缺点,我们曾报道过发明了一种复合的阳离子交换吸附膜(以下建成为MMM),其具有高动态结合容量,高处理能力,能够耐受高盐环境等特点。本次研究的目的是证明在实验室规模中用MMM技术纯化CHO细胞上清液中的单抗的可行性,脱盐柱被用于去除细胞上清液中的盐离子以提高MMM的捕获能力。MMM在中性pH的条件下进行上样及洗脱。同时对脱盐的MMM层析以及蛋白A层析的效果进行对比。通过考察两种手段的洗脱液中的单抗纯度以及宿主蛋白残留,对比两种技术的效果,两种技术均使用典型的工艺手段进行操作。

  B1缓冲液(20 mM PBS缓冲液,用HCl调节pH至6.45)用于蛋白结合能力实验。B2缓冲液由B1缓冲液加入0.15M NaCl制得,用作脱盐柱的平衡缓冲液。E1缓冲液(0.1 M柠檬酸,pH 3.0)用作蛋白A吸附柱洗脱缓冲液。E2缓冲液(1.0 M硫氢化钠,pH 8.0)用作MMM柱的洗脱缓冲液。所有的缓冲液均用超纯水(EMD-Millipore, Bedford, MA)配制,使用前超声处理。

  MMMs层析膜由我们实验室开发和制备。MMMs膜是一种修饰的多孔纤维素膜,膜表面包覆一层聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层,进而修饰以4-巯基苯甲酸。接着MMMs被切成直接18 mm的圆盘,装入Mustang®膜组件购买自美国颇尔(Port Washington, NY)。多个膜填充形成一个0.1 mL的吸附床。组成的吸附柱的死体积大概为0.5 mL。在将MMMs膜装入组件之前,膜依次用甲醇以及B1缓冲液浸泡。

  蛋白A树脂吸附柱(1 mL床体积,0.7 cm直径,2.5 cm高)以及脱盐柱(15 mL床体积,2.6 cm直径,10 cm高)购买自GE公司。

  使用商品化的牛IgG作为模式蛋白以对比MMM和蛋白A的动态结合能力。IgG溶液使用B1缓冲液配置,浓度约为3 mg/ml。IgG溶液在使用前需要过0.2 um无菌滤器。

  使用上样和洗脱的方式测量不同材料对蛋白的动态结合容量及饱和吸附量。相同的蛋白上样及平衡步骤用于操作蛋白A和MMM柱以对比二者效果。经典的一个层析循环的步骤如下:首先,吸附柱用15倍柱体积的B1缓冲液进行平衡。然后,将3 mg/mL的IgG溶液以1 CV/min的速度上样,直到流穿中IgG浓度与上样浓度相等,停止上样。接下来,用8 ml的B1缓冲液冲洗柱子上未结合的目的蛋白。最后,用洗脱缓冲液将结合的IgG从柱子上洗脱下来,知道洗脱液的紫外检测器280 nm检测信号呈平衡线用于洗脱蛋白A柱上的IgG,洗脱液E2用于MMM柱上IgG的洗脱。动态结合容量根据公式1计算:

  q代表结合能力,mg/ml;Vbreak代表当洗脱液紫外吸收为初始的10%时的洗脱液体积,mL;Vdead代表层析柱的死体积,mL,通过测量盐浓度为1 M的溶液的电导率确定;C0表示蛋白初始浓度,mg/mL;VCOl代表柱体积,mL。

  qe代表静态结合容量,mg/ml;Mp是洗脱蛋白的量,mg;用蛋白标准品制作280 nm的标准曲线以计算洗脱蛋白的量。

  两步层析用于从CHO细胞上清液中捕获以及纯化hIgG1。第一步,使用HiPrep 26/10脱盐柱进行脱盐,脱盐柱与AKTA连接,用B2缓冲液冲平。接下来,5 mL CHO细胞上清液以15 mL/min进行上样。收集第一个流穿峰,其中含有目的蛋白hIgG1。第二步,将MMM柱连接到AKTA上,用B1缓冲液以1 ml/min的流速冲平。上样2 mL经过脱盐的hIgG1,流速0.1 mL/min(停留时间1 min),然后用10 mL B1缓冲液冲洗未结合的蛋白。结合蛋白用洗脱液E2进行洗脱。收集洗脱峰,留待SDS-PAGE电泳分析检测。

  为了对比不同材料的分离效果,蛋白A吸附柱通过直接从CHO细胞上清液中捕获hIgG1进行评价。蛋白A吸附柱与AKTA连接并用B1缓冲液冲平。接着,20 mL的细胞上清液以1 mL/min的速度进行上样(停留时间1 min)。用10 mL的B1缓冲液洗去未结合的蛋白。结合蛋白用洗脱液E1进行洗脱。收集洗脱峰,留待SDS-PAGE电泳分析检测。

  初始的细胞上清液以及蛋白A吸附柱、脱盐柱、MMM柱的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。初始上清液及各个洗脱液的总蛋白浓度用牛IgG检测试剂盒进行检测。为方便评价各材料间的差异,每个SDS-PAGE凝胶电泳实验均含有IgG标准品。每一个SDS-PAGE凝胶电泳均用4-20%的预制胶以及500 mL的缓冲液(1X Tris-HEPES-SDS)配制。每个泳道上样25 μL,由样品与上样缓冲液以3:1比例混合而成。所有的凝胶电泳均在200V恒定电压下进行。完成后用蛋白银染试剂盒进行染色。

  宿主蛋白杂质的检测使用PallForteBio-Cygnus CHO细胞宿主蛋白检测试剂盒。初始CHO上清液以及蛋白A吸附柱、MMM层析的hIgG1洗脱液用试剂盒分析宿主蛋白杂质的含量。为了测量样品中宿主蛋白的含量,用20μg/mL CHO抗原配制一系列的宿主蛋白标准品(5,10,15,20μg/mL)。配制只有缓冲液的样品作为对照样品。

  我们用表面自由基聚合的方法设计、生产了第一个弱阳离子复合膜。多孔的MMMs对IgG由非常高的结合容量,并且不受离子强度干扰,特别是柠檬酸离子。因此MMMs应用在蛋白A层析步骤之后,用于精细纯化是非常有效的(不考虑缓冲液的置换/稀释),蛋白A层析一般用柠檬酸对目标蛋白进行洗脱。

  本项研究中,我们的主要目标是评估MMM复合膜柱与商品化蛋白A柱作为捕获介质纯化hIgG1的效果对比。捕获阶段纯化过程的评价直接用真实的CHO细胞上清液。上样-洗脱的层析或称用来从CHO细胞上清液中纯化hIgG1,MMM和蛋白A均使用这一过程。本项研究的第二个目的是对比在停留时间均为1 min时,MMM和蛋白A吸附树脂对IgG的动态结合容量,评价过程使用配制的IgG溶液评价两种吸附柱的动态结合容量。

  用上样-洗脱的层析操作评价MMM和蛋白A树脂柱的蛋白结合容量。使用牛IgG作为评价蛋白结合容量的模式蛋白。通过流穿曲线来测量在同样上样条件下不同材料的动态结合容量。体积流速均为1 CV/min(停留时间1 min)。我们已证明MMM可以使用更短的停留时间。之所以选择1 min的停留时间主要由于在此条件下蛋白A柱有更好的结合容量,而当流速增大,其结合容量显著下降。静态吸附容量通过蛋白上样过载的吸附柱的洗脱液中的目的蛋白的量进行计算。

  图1 MMM柱上样及洗脱(上样和平衡缓冲液B1:20 mM PBS,pH=6.45;洗脱缓冲液E2:1 M NaSCN;样品上样速度:0.1mL/min;上样量:30 mL;柱床体积:0.1 mL)。初始在缓冲液B1中IgG含量为3 mg/mL。实线 nm的吸收曲线,长的虚线代表电导率的变化。

  图2蛋白A柱上样及洗脱(上样和平衡缓冲液B1:20 mM PBS,pH=6.45;洗脱缓冲液E1:0.1 M 柠檬酸;样品上样速度:1mL/min;上样量:30 mL;柱床体积:1 mL)。初始在缓冲液B1中IgG含量为3 mg/mL。实线 nm的吸收曲线,长的虚线代表pH的变化。

  图1和图2显示了MMM和蛋白A树脂柱的结合和洗脱色谱图。牛IgG溶液上样直到流穿与初始溶液在680 mAu吸光值相等。结合的蛋白用合适的缓冲液洗脱紫外吸收曲线缓冲液冲洗。尽管两种柱子都可以实现回收,蛋白A吸附柱可以将IgG的浓度由3 mg/mL富集至6 mg/mL,而MMM将IgG浓度由3 mg/mL稀释至1.2 mg/mL。本研究在探索替代的洗脱策略以改善洗脱峰分辨率,这需要克服产品所带来的稀释效应,如同我们曾介绍过的其他膜层析一样。表1总结了MMM和蛋白A柱的静态结合容量,与蛋白A树脂相比,新的MMM柱有其4倍的牛IgG动态结合容量以及6倍蛋白饱和吸附量。HiTrap蛋白A吸附柱配基密度为每毫升3 mg 蛋白A,如果假设IgG与蛋白A的结合比例为2:1,那么蛋白A吸附柱的结合容量约为每毫升22 mg IgG,这种假设与我们的实验结果相一致。MMM的高结合容量主要由于配基密度高以及膜孔表面聚合物链的作用。

  MMM和蛋白A树脂柱的动态结合容量和静态结合容量的区别是比较明显的。在之前的研究中,我们发现由于配基的疏水性导致配基的偶联反应非常的慢,这种情况下进而影响了聚合物的构造以及易接近的结合位点的数量。实验现象表明随着时间的增长聚合物层内的蛋白的静态吸附量明显的增大,主要原因是由于聚合物层吸水膨胀进而产生了新的蛋白结合的位点和空间。然而,如果停留时间过短以至于无法发生这一现象,则吸附平衡会很快达到。

  使用模式蛋白溶液如牛IgG溶液等作为新材料验证的工具;然而,为了验证材料的实际的使用效果,材料必须要在天然的细胞上清液中进行验证。天然的细胞上清液的纯化过程中可能遇到在模式蛋白溶液的纯化过程中遇不到的问题。因此,下一步实验是验证MMM从细胞上清液中纯化hIgG1的纯化效果。蛋白A树脂以及MMM被用于作为固定相从CHO细胞上清液中纯化hIgG1。控制体积流速以使纯化的停留时间保持在1 min。牛IgG与MMM相结合的最适pH为6.45,同时蛋白A柱的操作手册说明其最适pH为6-7。因此pH=6.45作为两种材料吸附过程中缓冲液的pH。

  图3蛋白A层析用于从CHO细胞上清液中捕获hIgG1,(上样以及平衡缓冲液B1:20 mM PBS,pH6.45;洗脱缓冲液E1:0.1M 柠檬酸,pH3.0;上样流速:1mL/min,上样体积:20 mL,柱床体积:1mL)。实线 nm的吸收曲线,虚线代表pH变化曲线,垂直的虚线代表样品洗脱收集的范围。

  图3为使用蛋白A树脂柱吸附细胞上清液中的hIgG1。上样直至流穿液在840 mAu处吸光值与上样吸光值一致。hIgG1会特异性的与蛋白A配基相结合,而宿主蛋白以及其他杂质会流穿,当然介质也会与很小的一部分非特异性蛋白结合而造成一些结合的杂质。用合适的洗脱液将结合的hIgG1进行洗脱,洗脱样品收集待用SDS-PAGE电泳分析。

  图4脱盐柱去除细胞上清液中过量盐的过程(上样缓冲液B2:20 mM PBS含150 mM NaCl,pH6.45,;上样流速:15 mL/min;上样体积:5mL;柱床体积:53 mL)。垂直的虚线代表收集的富集hIgG1的洗脱范围。

  图5 MMM层析用于从脱盐柱的富hIgG1中捕获纯化hIgG1(上样及平衡缓冲液B1:20 mM PBS,pH=6.45;洗脱缓冲液E2:1.0 M NaSCN,pH=8.0;样品上样流速:0.1 mL/min;样品上样体积:2 mL;吸附剂柱床体积:0.1 mL)。实线 nm吸光曲线,虚线代表电导率曲线显示的是用脱盐柱和MMM柱层析方法从CHO细胞上清液中纯化hIgG1。由于我们最近的研究显示过高的盐浓度会影响蛋白与MMM的结合,脱盐柱的主要目的是除掉细胞培养过程中过量的盐。蛋白上样量实验显示上样5 ml的细胞上清液拥有最好的分离效率。因此,脱盐柱采用5 ml的上样量,上样完成后用B2缓冲液进行洗脱,蛋白和盐依靠分子量大小的区别实现分离。根据厂商的建议,为了避免柱内蛋白洗脱不充分,B2缓冲中加入了150 mM的NaCl以消除脱盐柱中的库仑力作用。图4显示收集第15-23 ml(共计9 ml)的hIgG1洗脱液组分用于SDS-PAGE分析,随后样品通过MMM柱层析。在产品洗脱峰之后的洗脱峰是低分子量蛋白、多肽以及细胞上清液中的其他紫外吸收组分。

  MMM柱首先用B1上样缓冲液进行平衡。随后上样2 mL经过脱盐的hIgG1溶液。有报道显示hIgG1的等电点为8.6±0.4。因此,在溶液环境中pH为6.45时,带正电荷的hIgG1分子与带负电的MMMs结合。同时hIgG1之上的疏水结构域与MMMs上的疏水基团相结合,这样即使在150 mM NaCl的溶液环境下仍能保持很强的结合能力。先前的研究显示150 mM NaCl环境只对MMM的结合能力由次要的影响。图五中显示的时MMM层析过程的曲线。上样过程中,污染物及未结合的蛋白流穿显示为曲线中的第一个峰。结合的蛋白经E2缓冲液(1M NaSCN in Buffer B1, pH=8.0)的梯度洗脱下来。就像我们之前报道的一样,高浓度的NaSCN会阻断吸附蛋白与MMM之间的库仑力作用及疏水作用。同时将溶液环境提高至pH 7.5以上将改变hIgG1所带电荷,从而将结合蛋白从MMM柱上洗脱下来。图五中的第二个峰为洗脱峰,收集洗脱样品用于SDS-PAGE电泳分析。实验重复三次,结果一致。

  SDS-PAGE电泳用于评价MMM和Protein A从CHO细胞上清液中纯化hIgG1的能力。蛋白A柱洗脱峰样品体积为2 mL,hIgG1浓度为1.1 mg/mL。MMM柱洗脱峰样品体积为2 mL,hIgG1浓度为0.053 mg/mL。MMM柱洗脱液中hIgG1浓度较低主要由于前处理步骤中脱盐过程的稀释作用。脱盐后,洗脱液中的目的蛋白浓度为0.065 mg/mL。由于饱和结合容量取决于溶液中目的蛋白浓度,因此较低的初始浓度也造成了MMM柱较低的载量。

  图6 蛋白A柱与MMM柱从CHO细胞上清液中捕获纯化hIgG1纯度对比

  图6为Protein A柱及MMM柱hIgG1洗脱峰中hIgG1与其他杂质蛋白的银染电泳图。同时以用考马斯亮蓝法染色的电泳图作为对比。银染法能够显示出样品中非常低浓度的蛋白(0.25 ng/lane),而考马斯亮蓝法的检测限相对较高(7 ng/lane)。图6显示CHO细胞上清液中主要的蛋白质为hIgG1。Lane2中在50和25kDa的两个条带,显示了hIgG1的重链以及轻链。然而,电泳图显示仍有一些明显的CHO细胞宿主蛋白。图6中Lane 3显示蛋白A柱可以纯化得到高纯度的hIgG1与期望的一致。此外,图6Lane 5显示二步的MMM层析同样能够得到高纯度的hIgG1。定量分析也验证了这一结果。证明了当Protein A柱层析不是一个很好的选择时,样品脱盐后进行MMM柱层析是一个非常好的选择。

  表2对比了Protein A柱层析与两步的MMM层析hIgG1的纯度、收率以及宿主蛋白水平。尽管两种方法都有一些限制条件,但两种方法都能够取得高收率。MMM层析需要进行脱盐前处理,这将导致样品的稀释;同时,蛋白A层析要求酸性的洗脱条件可能导致目的蛋白的失活以及蛋白聚集。两种层析方法的洗脱条件都需要较高的盐浓度,这将要求后续进行精纯之前需要一步脱盐处理。

  在生物制药的生产过程中,残余的CHO细胞宿主蛋白存在降低药物有效性的风险,同时可能在病人体内引起免疫反应。因此,检测残留宿主蛋白对于药物的安全性和质量是非常重要的一步。通常要求宿主蛋白水平不得高于100 ppm。在这项研究中,使用抗CHO宿主蛋白检测试剂盒进行ForteBio定量检测分析被用于检测hIgG1产品中的宿主蛋白水平。表2显示了蛋白A层析和MMM层析中宿主蛋白的水平都远远低于初始的CHO细胞上清液,初始的CHO细胞上清液中宿主蛋白的水平约为6700 ppm。这一结果显示两种方法都可以高选择性的从CHO细胞上清液中纯化hIgG1。由于MMM层析的分离机理基于库仑力及疏水作用,并不需要目的蛋白有Fc结合域,因此两步的MMM层析过程可以用于选择性的捕获、纯化大部分的目标蛋白。

  综上,这项研究证明了MMM层析是一种用于捕获蛋白的高吸附容量,高选择性的分离技术。当在脱盐步骤后应用MMM层析,MMM柱可以有效地从CHO细胞上清液中提取hIgG1,同时中性pH洗脱得到的目的蛋白纯度高,宿主蛋白杂质水平也与蛋白A层析相近。停留时间为60 s时,MMM柱的动态吸附容量比商品化的Protein A更高,这将减少纯化过程的周期,同时提高过程处理量。

  鉴于短期内在单克隆抗体的捕获纯化过程中用MMM层析替代Protein A层析是不太可能的,脱盐处理与MMM层析应用于实验室规模的蛋白捕获层析将是一个非常好的选择,特别是当单抗对pH敏感或缺少Fc结合域而导致Protein A柱无法使用时。

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